اجزاي واكنش PCR

اجزاي واكنش PCR

آنزيم 

ورود DNA پلي مراز هاي مقاوم به حرارت در تكنيك PCR يكي از پيشرفت هاي مهم در هر چه قابل دسترس شدن اين روش در آزمايشگاه ها بوده است. DNAپلي مراز Taq و Ampli Taq از پرمصرف ترين انزيم هاي مقاوم به حرارت درPCR مي باشند. Taq از باكتري Termus aquaticus، يك باكتري حرارت دوست استحصال مي شود كه اولين بار از يك چشمه آب گرم جدا گرديد. اين انزيم قادر است در درجه حرارت بهينه بين 70 الي 80 درجه سانتي گراد، بين 35 الي 100 نوكلئوتيد در ثانيه را پليمريزه كند. ژن كد كننده آنزيم Taq در باكتري اشريشيا كلي كلون شد و نوع جديدي از آن به نام Ampli Taq توليد و روانه بازار شد. از لحاظ خصوصيات Ampli Taq كاملا شبيه به Taq بوده و تنها تفاوت آنها نوتركيب بودن Ampli Taq مي باشد و عموما Ampli Taq در آزمايشگاهها بيشتر مورد استفاده قرار مي گيرد.

آنزيم Vent DNA polymerase از ديگر پليمرازها ي مقاوم به حرارت است كه اولين بار از باكتريThermococoous Litoralis جدا گرديد اين باكتري يك اركي باكتر حرارت دوست است كه در اعماق اقيانوس ( و در دماي بالاتر از 98 درجه سانتي گراد ) جداسازي شد. شركت New England Biolab ژن كد كننده اين انزيم را در باكتري اشريشيا كلي كلون كرد. انزيم Vent در برابر حرارت مقاومتر از Taq مي باشد  و قادر است محصول PCR حتي بزرگتر از 8 الي 13 Kb را پليمريزه كند. انزيم Vent داراي خاصيت ذاتي اگزونوكلئازي َ3 به َ5 مي باشد. لذا مولكول DNA با انتهاي َ3-OH ناجور (به طور نادرست جفت شده) بوسيله اين انزيم صحيح مي گردند. در نتيجه خاصيت ويراستاري و صحت آن 5 تا 15 برابر بيشتر از DNA پليمراز Taq مي باشد.

آنزيم Rfu، يكي ديگر از پليمراز هاي مقاوم به حرارت مي باشد كه از يك اركي باكتر بنام Pyrococcus Furiosus جدا گرديده است . اين انزيم به دليل داشتن خاصيت اگزونوكلئازي َ3 به َ5 داراي قدرت ويراستاري بالا  و توانايي تصحيح باز ناجور است.

جهت بهينه سازي يك واكنش PCR توصيه مي شود كه غلظت هاي مختلف انزيم مورد بررسي قرار گيرد. طيف غلظت بين 5/0تا 5 واحد انزيم در 100 ميكروليتر است. بايد توجه داشت كه انزيم هاي توليد شده توسط شركت هاي مختلف با يكديگر متفاوت مي باشند. بنابرين يك واكنش PCR در مورد انزيم مورد استفاده بايد بهينه سازي شود. اگر غلظت هاي آنزيم مورد استفاده زياد باشد، قطعات غير اختصاصي در محصول PCR ديده خواهد شد و چنانچه مقدار آنزيم كمتر از حد مورد نياز واكنش باشد، محصول مورد نظر به اندازه كافي توليد نمي شود.

بافرPCR

 بافر هاي متعددي براي PCR قابل دسترس است. معمولترين بافر مورد استفاده براي Taq  و Ampli Taq  كه به شكل10X ارائه مي گردند، عبارتند از: Tris –HCl 100 ميلي مولار با PH برابر با 3/8  و KCl 500 ميلي مولار.

 معمولا نمك KCl يا سولفات آمونيوم در بافر استفاده مي كنند. بايد توجه داشت كه غلظت هاي نهايي نمك، بيش از 50 ميلي مولار مانع فعاليت آنزيم Taq  مي شود.

 اجزاي بافر PCR مورد استفاده در ساير DNA پليمراز هاي مقاوم به حرارت متفاوت است . اكثر توليدكنندگان ، بافر 10X را همراه با انزيم مربوطه ارائه مي دهند.

 داكسي نوكلئوزيد تري فسفات (dNTP)

همانطور كه در سنتز طبيعي DNA 4 نوكلئوتيد مورد استفاده قرار مي گيرند، در واكنش PCR نيز 4 نوكلئوتيد به فرم(dATP , dTTP  , dCTP , dGTP ) مورد نياز است. نوكلئوتيد ها معمولا به طور جداگانه و يا مخلوط، به صورت تجاري عرضه مي شوند. معمولا براي رقيق كردن آنها از آب دو بار تقطير و يا ديونيزه كه قبلا PH آن روي 7 تنظيم شده استفاده مي كنند. بايد توجه داشت كه غلظت برابر هر يك از نوكلئوتيد ها مورد استفاده قرار گيرد. در غير اين صورت اشتباه جايگزين كردن ايجاد مي شود. و توالي محصول PCR با توالي الگو يا هدف متفاوت خواهد بود. در واكنش PCR معمولا غلظت نهايي مخلوطdNTP برابر 1/0 تا 2/0 ميلي مول در نظر گرفته مي شود. چنانچه اندازه محصول مورد نظر كوچك و تعداد سيكل PCR برابر و يا كمتر از 30 سيكل باشد مي توان از غلظت كمتر dNTP  استفاده كرد. چنانچه مقدار dNTP بيشتر از نياز واكنش باشد، احتمال تشكيل قطعات غير اتصاصي وجود دارد. تجمع قطعات غير اختصاصي مانع تكثير كافي قطعه مورد نظر شده، اختصاصي بودن واكنش را كاهش مي دهد و مصرف مواد اوليه كارايي سيستم را در تكثير قطعات دچار نقصان مي كند. 

مي توان انواع نوكلئوتيد هاي تغيير يافته را از طريق بكار بردن انالوگ هاي dNTP در واكنش PCR  وارد محصول نمود و از اين طريق محصولات را آشكار و يا رديابي كرد.

يون منيزيم  (Mg⁺⁺)

از مواد بسيار مهم واكنش PCR است كه بهتر است براي هر واكنش PCR بهينه شود. غلظت نهايي (Mg⁺⁺) در مخلوط واكنش مي تواند متغيير باشد. معمولا اين ميزان  mM 5 – 5/0 است.  بطور معمول ، مقدار كم (Mg⁺⁺) كه به صورتMgCl₂ عرضه مي شود منجر به محصول كم شده و مقدار اضافه آن منجر به جمع شدن محصول غير اختصاصي مي شود.

غلظت يون منيزيم در موارد زير در نتيجه واكنش دخالت دارد:

-          اتصال پرايمر ها: با افزايش غلظت (Mg⁺⁺)، قدرت اتصال پرايمر ها افزايش مي يابد و دماي اتصال بالاتري نياز خواهد شد و همچنين تمايل اتصال پرايمر ها به توالي هدف و اتصال غير اختصاصي آنها با سكانس ها الگو افزايش مي يابد. اين امر از طريقي سبب افزايش حساسيت واكنش مي شود و از طرف ديگر اختصاصي بودن واكنش را مي كاهد. تشكيل پرايمر دايمر نيز با افزايش يون منيزيم افزايش مي يابد كه باعث مي گردد پرايمر هايي كه به صورت لوپ با خودشان و يا به صورت دوتايي با يكديگر اتصال يافته اند، به طور غير اختصاصي تكثير يابند و تجمعي از قطعات كوچك پديد آورند كه اين وضعيت موجب خروج مقداري از پرايمر ها از واكنش مي گردد.

-          دماي واسرشت يا جداسازي رشته ها DNA: با افزايش غلظت يون منيزيم جدا شدن دو رشته DNA از هم در رو رشته ايي الگو و هم در محصول PCR با تاخير بيشتري انجام مي شود. بنابراين زمان در نظر گرفته شده براي مرحله واسرشت ( دناتوراسيون) بايد بيشتر شود.

-          فعاليت انزيم DNAپليمراز: يون منيزيم، فعاليت پليمرازي آنزيم را افزايش مي دهد. اين انزيم جهت فعاليت پليمرازي خود به يون آزاد (Mg⁺⁺) نياز دارد.

-          dNTPs: يون منيزيم با نوكلئوتيد ها تركيب شده و كمپلكس محلولي را توليد مي نمايد كه يك نياز اساسي جهت ورود و جايگزين شدن آنها در زنجيره DNA  در واكنش PCR است. 

 DNA   الگو 

الگو در PCR مولكول RNA  يا DNA تك رشته اي  و يا دو رشته اي است. به طور بالقوه، PCR قادر است با يك كپي از الگو نتيجه بخش باشد. لذا بايد مراقبت هاي شديدي از نظر آلودگي، در روش هاي تكثيري اعمال شود. اگر چه PCR قادر است حتي يك مولكول تك را در مقادير نانوگرم از DNA الگو تكثير نمايد. با اين وجود بايد تعداد بيشتري از مولكول هدف، موجود باشد. تا جواب هاي مناسب و ايده آل بدست آيد.

آغازگر ها (Primer)

در واكنش PCR آغازگر ها ( پرايمرها ) در دو طرف توالي هدف اتصال مي يابد و امكان شروع فعاليت DNAپلي مراز را فراهم مي كنند. بنابراين اولين خصوصيت پرايمر، توالي صحيح آن جهت مكان مورد نظر براي تكثير است. با در دسترس بودن توالي مورد نظر امكان مشخص نمودن توالي پرايمر فراهم مي آيد . و سپس بايد اندازه آنها را مشخص نمود. بطور معمول پرايمرها ي مورد استفاده بين 20 الي 30 نوكلئوتيد دارد كه منتج به استفاده از دماي بالا تكثير شده ( سختي زياد ) و در عين حال از لحاظ آماري، تعداد محل هاي چسبيدن براي پرايمر حتي در بزرگترين DNA الگو هم فوق العاده كاهش مي يابد. هر قدر پرايمر ها طول بيشتري داشته باشند امكان اتصال آنها كمتر است. اما از طرف ديگر استفاده از پرايمر هاي طويل، امكان اتصال به خود و يكديگر را افزايش داده و تشكيل پرايمر دايمر و پلي مريزه شدن آنها را تشديد مي كند. و همچنين زمان اتصال آنها به الگو را افزايش مي دهد. اين پديده بيشتر هنگامي رخ مي دهد كه طول در نظر گرفته شده براي پرايمر بيش از 30 باز باشد . تشكيل پرايمر دايمر بويژه در سيكل هاي اوليه PCR كه تجمع آنها زياد است اتفاق مي افتد.

يك پرايمر تا انجايي كه ممكن است بايد تعداد مساوي از هر 4 باز داشته باشد و مناطق غني از پلي پورين و پلي پيريميدين موتيف هاي تكراري نداشته باشد. ترادف پرايمر نبايد موجب ايجاد ساختمان ثانويه در آن گردد. پرايمر هاي پيشرو و معكوس نبايد به هم بچسبند. به خصوص در ناحيه َ3 پرايمر ها، نبايد توالي هاي مكمل وجود داشته باشد تا از تشكيل پرايمر دايمر جلوگيري شود.

فاصله ميان پرايمر ها عموماٌ كمتر از 10 kb است. تكثير قطعات بيش از kb 3 مشكل و در عين حال ميزان بازده سنتز هم پايين است.