سيكل هاي PCR
مرحله واسرشت (Denaturation)
در اين مرحله دورشته DNA هدف و همچنين پرايمر ها و ساختمان ثانويه آنها از يكديگر جدا مي شوند. براي اين مرحله دماي 100 تا 92 درجه سانتي گراد در نظر گرفته مي شود.
چنانچه زمان يا دماي كافي براي مرحله واسرشت در نظر گرفته نشود، باز نشدن كامل رشته هاي DNA باعث كاهش كارايي واكنش مي گردد. اگر در مرحله واسرشت دما بسيار و يا زمان طولاني باشد موجب از دست رفتن و غير فعال شدن مواد موجود در واكنش شده و فعاليت آنزيم را كاهش مي دهد نيمه عمر انزيم Taq در 5/97 درجه سانتي گراد 5 تا 6 دقيقه، در 95 درجه سانتي گراد 40 دقيقه و در 5/92درجه سانتي گراد 130 دقيقه مي باشد.
مرحله اتصال (Annealing)
با كاهش دما از مرحله واسرشت به تدريج مولكول DNA تك رشته اي مكمل هاي خود را پيدا مي كند و با آنها اتصال مي يابد. به دليل اينكه تغيير دما از زياد به كم انجام مي شود ابتدا اتصال اختصاصي اتفاق مي افتد و سپس با كاهش بيشتر دما تعداد اتصالات غير اختصاصي افزايش مي يابد هر چه GC پرايمر، غلظت و طول آن بيشتر باشد دما و زمان در نظر گرفته در اين مرحله بيشتر خواهد بود كه در مورد هر جفت پرايمر و هر سيستم PCR بايد به طور اختصاصي محاسبه شود.
مرحله ساخت (Extension)
دماي اين مرحله بين 70 تا 72 درجه سانتي گراد در نظر گرفته مي شود و زمان مورد نياز به طول سكانس هدف پاياني معمولا زمان 5 تا10 دقيقه اي براي اين مرحله در نظر گرفته مي شود كه با توجه به كاهش مواد اوليه مثل dNTP و پرايمر در سيكل آخر و احتمال وجود محصولات كوتاه، زمان كافي را براي ساخت كامل زنجيره هاي مكمل فراهم مي سازد.
تعدادسيكل ها
هنگامي كه ديگر پارامتر هاي يك سستم PCR بهينه شده باشند، تعداد سيكل به مقدار DNA اوليه وابسته خواهد بود. يك پروتكل معمول PCR شامل 25 الي 50 سيكل حرارتي است. بر حسب نمونه و نوع موجودي كه DNA از آن استخراج شده تعداد سيكل ها تنظيم مي شود.
پديده پلاتو واژه اي است كه در مورد خارج شدن روند سنتز محصولات PCR از حالت تصاعدي اطلاق مي شود. در اين پديده با افزايش تعداد سيكل بر خلاف انتظار تئوريك، افزايش محصول نخواهيم داشت. اين حالت مي تواند بعلت تخريب مواد اوليه و يا كاهش و مصرف آنها و همچنين تجمع مواد مهار كننده حاصل از پلي مريزاسيون نوكلئوتيد ها باشد و گاهي رقابت بين سنتز قطعات غير اختصاصي با قطعه اصلي موجب ايجا پديده پلاتو مي شود.
آيا انسان با ميمون نياي مشترك دارد يا موجودي متفاوت است